MADRID, 7-11 de Julio de 2003MADRID, 7-11 de Julio de 2003
Fernando Valcarce Codes
INSTITUTO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA. MADRID.
INTRODUCCIÓN:
Es sabido que el monóxido de carbono (CO) es uno de los compuestos que mayor incidencia tiene en intoxicaciones agudas, accidentales y suicidas, siendo también un factor de riesgo importante en enfermedades respiratorias y cardiovasculares que pueden empeorar cuando los niveles que se alcanzan en sangre son superiores a los admisibles [1].
A diferencia de otros gases, como el butano o el propano, el CO es altamente reactivo frente a la hemoglobina (Hb) de la sangre y sólo una pequeña fracción del orden del 0.01% del total permanece disuelta sin reaccionar con la Hb, reaccionando la mayor parte para formar carboxihemoglobina (COHb) compuesto que es inhábil para el transporte de oxígeno a las células, produciéndose la anoxia de las mismas.
Por ello, el nivel de COHb en sangre nos da una indicación del grado de intoxicación o impregnación por CO sufrido por el organismo y su determinación ha sido objeto de numerosas investigaciones y desarrollo de variados métodos de medida de los cuales los espectrofotométricos son los más usados por su sencillez y reproducibilidad [2].
Con frecuencia se suele determinar la fracción molar de COHb frente a la Hb total, lo cual facilita los cálculos y los procesos experimentales y además nos proporciona información suficiente sobre la situación respiratoria del organismo afectado. No obstante, en ciertas ocasiones puede necesitarse algo más de información sobre el nivel de CO presente en la muestra de sangre y resulta interesante disponer de un método , como el que aquí se presenta , que nos permita conocer en la misma medición la fracción molar de COHb y la concentración absoluta de CO de una forma sencilla , precisa , y que sólo necesita 50 microlitros de muestra.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO:
Recientemente se ha descrito un método espectrofotométrico para el análisis de COHb en sangre que es lo suficientemente preciso como para poder determinar valores pequeños de COHb , del orden del 1%, cuando las condiciones instrumentales son las adecuadas [3]. En este método se parte de 50 microlitros de sangre que se ponen en disolución con agua destilada al 0.1 % y se transfieren 3 ml de ésta disolución a una cubeta de espectrofotómetro a la que se añaden 15 mg de hidrosulfito sódico, leyendo entonces los valores de absorbancia a 432.0 nm (A2) y a 416.0 nm (A6) procediendo después a calcular la fracción molar, x , de COHb por medio de la expresión:
(1)
donde las constantes a, b , y c se obtienen saturando de oxígeno y de monóxido de carbono múltiples muestras de sangre y promediando los valores obtenidos. La incertidumbre instrumental en la medida de x , nos viene dada por Dx que resulta ser de la forma : Dx = [(a + b + (c - 1) . x) / (A6 + c . A2)] . DA , siendo DA la incertidumbre en la medida de A.
En una muestra en la que sólo hay COHb y Hb reducida, tenemos:
(2)
donde l es la trayectoria del haz de radiación en la muestra, d la concentración total de Hb y e es la absortividad molar del compuesto indicado a la longitud de onda correspondiente.
Operando obtenemos :
(3)
k = e(432)Hb - e(432)COHb también se puede expresar en función de l, b, c, x, y A6 como : k = A6 / [(b + c . x). l . d] (4) por lo que, una vez conocido el valor de d en una o varias muestras patrón , podemos establecer el valor de k y conocer cualquier otro valor de la concentración de hemoglobina total a partir de (4) ó de :
(5)
El valor de la constante k ha de determinarse a partir de valores de concentración de Hb que sean conocidos en materiales de referencia y en nuestro caso se ha obtenido , a falta de otro material certificado , en base a muestras control procedentes de un control de calidad inter-laboratorios de ámbito internacional [4].
Una vez conocidas la fracción molar de COHb y la concentración de hemoglobina total , podemos conocer la concentración de COHb que será : c(COHb) = x . d . La relación entre los pesos moleculares del monóxido de carbono y el de la carboxihemoglobina es de 112 a 64470 por lo que la concentración de CO se determina por : c(CO) = 112 . x . d / 64470 (6) , en donde conocidas x y d podemos saber la concentración de monóxido de carbono en la muestra de sangre de que se trate, excepto quizá por un 0.01% que puede estar en disolución y no ligado a la Hb.
Los valores habituales de ésta concentración en casos reales pueden estar comprendidos entre ; 1 y 300 microgramos / ml aproximadamente, si consideramos que el valor de x puede variar entre 0.01 y 0.90 y la concentración de hemoglobina suele estar entre 6 y 20 g / dl en los casos más frecuentes.
REFERENCIAS
Anotaciones:
1.- Las constantes a, b y c de la expresión (1) pueden presentar ligeras variaciones dependiendo del espectrofotómetro concreto que se utilice en la medida por lo que es conveniente hacer su determinación que viene descrita en la Referencia 3.
2.- Igualmente habría que determinar las constantes a, b y c en el caso de que queramos aplicar el método para sangre de otros animales.
3.- La determinación de las constantes a, b y c se realiza saturando de oxígeno una disolución de una muestra que tenga un contenido inicial bajo de COHb , midiendo los valores de absorbancia a las dos longitudes de onda de interés, y después saturando de monóxido de carbono hasta el máximo posible la misma disolución anterior y volviendo a medir los valores de absorbancia con lo que aplicando las expresiones descritas para los coeficientes de absortividad podremos encontrar los valores de las tres constantes.
En concreto tendremos:
siendo D = A( 432 )0 - A( 432 )1 ,, donde A representa el valor de la absorbancia, 416 y 432 las longitudes de onda a las que se mide y 0 y 1 se refieren a muestras con 0 y 100% de COHb , respectivamente.